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    研究背景

    自身免疫性疾病 ,如係統性紅斑狼瘡(SLE) 、類風濕關節炎(RA)和1型糖尿病等 ,是由於機體自身免疫耐受出現異常的結果 。一般情況下 ,機體有一係列控製自身反應性T 、B細胞的機製 。克隆消除是免疫係統發展過程第一位的選擇機製 ,又稱陰性選擇 。克隆消除是一種中樞耐受 ,它可以將對自身抗原產生應答的T細胞進行清除 。但是 ,這一機製並不徹底 ,一些自身反應性T細胞可以從這一消除機製中逃逸 ,從而進人外周係統造成全麵破壞 。為了調節這些可能產生自身損害的T細胞 ,機體在外周係統產生了外周耐受 ,包括克隆無能 、外周清除 、免疫忽視和一係列調節性T細胞(Treg) 。當機體Treg的數量減少或功能減退時 ,便會出現自身免疫性與變態反應性疾病 。如下圖所示 。

    Treg種類非常多 ,根據細胞表麵CD4分子是否表達可分為CD4+Treg細胞與CD4-Treg細胞 。CD4+Treg在數量上約占人體內外周係統CD4+T細胞的1%-2% 。其他Treg尚處於探索階段 。CD4+Treg可分為自然Treg(nTreg)和適應性Treg(iTreg) 。nTreg是目前研究最多的Treg種群 ,最早由Sakaguchi等發現部分CD4+T細胞可高表達IL-2受體的α鏈(CD25) ,並證實具有免疫調節性 。CD25是最早被證實的Treg標誌物 ,但它也表達於活化的CD4+T細胞 。一些研究表明CD127(IL-17受體的α鏈)可鑒別人類Treg與活化的CD25+T細胞 ,Treg被認為是CD127low ,活化的CD25+T細胞被認為是CD127high 。Foxp3是Treg發育與功能表達過程中的一個重要轉錄因子,也是重要的鑒別標誌物 。
    Sakaguchi等最早證明了Treg在自身免疫反應進展中的重要性 。將CD4+中的CD4+CD25+T細胞去除 ,在特異性抗CD25抗體輔助下注入無胸腺的小鼠體內 ,結果小鼠出現一係列自發的自身免疫疾病 ,如甲狀腺炎 、胃炎 、胰島炎、腎小球腎炎 、多關節炎等 。再用CD4+CD25+T細胞注入上述小鼠體內替換CD4+CD25-T細胞 ,上述自身免疫性疾病均得到了有效的控製 。Treg發揮調節作用的主要機製有 :(1)分泌抑製性細胞因子 ,如IL-10 、TGF-β和IL-35 ,並促進其發揮效應。(2)分泌穿孔素與顆粒蛋白酶 。(3)代謝破壞 ,Treg通過對生長性細胞因子IL-2的剝奪使效應性T細胞凋亡 。(4)對抗原遞呈細胞增殖和功能的抑製性調節 。
    一直以來 ,對於人類RA的研究往往傾向於量化外周血中的Treg細胞 ,同時在免疫反應中進行定位 。在RA患者中 ,滑液中的Treg比外周血中的Treg要高一些 ,累積在炎症關節中的Treg高水平表達CTLA-4 、糖皮質激素誘導的腫瘤壞死因子受體(GITR) 、OX-40和Foxp3 。一些關於健康人群與RA患者循環係統中Treg的數量比較研究 ,均未得出顯著性結果或呈現互相矛盾結果 。一些研究結果表明RA患者Treg水平下降 ,但也有相當一部分研究未發現兩組人群的顯著差異或RA患者Treg水平增高 。盡管RA患者滑液中Treg的增多可以抑製T細胞的增殖與促炎細胞因子(TNF-α 、IFN-γ)的釋放 ,但是炎症反應仍然可以繼續發生 。滑液中效應性T細胞與循環係統中效應性T細胞相比 ,其對Treg調節作用的敏感性較低 。這些數據與高度活化的CD4+T細胞對Treg調節作用的抵抗現象相符合 。
    研究模型
    南宮娛樂已經掌握了調節性T細胞的原代分離培養 :製備單個細胞懸液 ,以T細胞純化柱分離小鼠淋巴結或脾髒T淋巴細胞 ,以抗CD8-FITC抗體和抗FITC標記磁珠相結合的陰性選擇法剔除CD8+T細胞 ,再以抗CD25-FITC抗體和抗FITC標記磁珠相結合的陽性選擇法選出CD25+T淋巴細胞 。也可采用CD4+T細胞亞型純化柱分離得到CD4+T細胞 ,再結合抗CD25-FITC抗體 ,以流式細胞儀分選出純化的CD4+CD25+T細胞 。如下圖所示 。

    南宮娛樂建立了調節性T細胞抑製功能檢測模型 :將Treg與CD4+CD25–或CD4+應答性T細胞(Tresp)以不同的比例共培養 ,並加入多克隆刺激劑 。單獨的Tresp細胞會有很快的增殖反應(anergy) 。而二者共培養後會導致Tresp細胞的增殖減弱 。抑製實驗可以使用Tresp與Treg細胞的不同比例 ,如從1:1到8:1 ,作為對照 ,可以將Treg和Tresp細胞在加檢測劑和不加檢測劑的情況下單獨培養。如下圖所示 。

    研究案例
    目的 :探明類風濕關節炎(RA)時調節性T細胞和Th17細胞這兩種亞群在外周血中的分布特征 ,進一步分析導致該免疫狀態的分子機製 ,明確Notch信號分子在RA外周血T細胞中的表達特性
    結論 :RA患者外周血存在Treg/Th17失衡 ;Th1和Th17相關的細胞因子增多 ,外周血T細胞內Notch信號呈顯著活化狀態 。
    路線 :
    • 選取活動期及穩定期RA患者 ,采取流式細胞術細胞內染色技術檢測外周血中調節性T細胞和Th17細胞百分比 ,並應用qPCR檢測這兩種細胞特異的轉錄因子FoxP3和ROR的表達水平
    • RA患者同時檢測調節性T細胞和Th17細胞百分比 ,計算Th17/Treg比值 。同時采用流式芯片技術檢測血清中11種細胞因子 ,觀察外周血中細胞因子微環境特征 ,並分析與Th17/Treg比值的相關性
    • 采用流式細胞術檢測RA外周血T細胞Notch受體分子的表達 。應用免疫磁珠分離純化外周血T細胞 ,通過qPCR檢測Notch受體及靶基因表達水平 。應用WB檢測T細胞內Notch胞內段核移位 。
    核心文獻
    • Interleukin-35 induces regulatory B cells that suppress autoimmune disease. Nat Med. 2014 Jun;20(6):633-41. https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/pmid/24743305/
    • Good guys gone bad: exTreg cells promote autoimmune arthritis. Nat Med. 2014 Jan;20(1):15-7. https://dx.doi.org/10.1038/nm.3439
    • Pathogenic conversion of Foxp3+ T cells into TH17 cells in autoimmune arthritis. Nat Med. 2014 Jan;20(1):62-8. https://dx.doi.org/10.1038/nm.3432
    • TNF-α trips up Treg cells in rheumatoid arthritis. Nat Med. 2013 Mar;19(3):269-70. https://dx.doi.org/10.1038/nm.3124
    • Phosphorylation of FOXP3 controls regulatory T cell function and is inhibited by TNF-α in rheumatoid arthritis. Nat Med. 2013 Mar;19(3):322-8. https://dx.doi.org/10.1038/nm.3085

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